农药残留分析技术

农药残留分析技术

2. 1  食品样品的分类及相应分析方法概述


 AOAC( 美国分析化学家组织) 方法是国际承认的多种农药残留分析的代表性方法。它将食品按其脂肪、糖和水分含量的多少来划分,根据不同的样品     [10] 。选择相应的分析方法。样品划分如图 1 所示但是实际的样品种类繁多,仅以图 1 的分类方法确定农药残留前处理方法不能完全适用于所有样品,不同基质对残留农药测定的干扰也各有不同,所以实际食品中农药残留分析方法还要更进一步考虑样品基质特性问题。表 1 依据 AOAC 食品样品分类对前处理及检测方法进行汇总。 

2. 2  前处理技术

食品中农药残留分析的样品前处理是指将残留农药从样品中最大限度地提取出来,消除分析过程中的干扰物,为下一步的分析检测提供保障,主要包括提取、净化和浓缩等步骤。食品中农药残留物含量低、基质复杂、干扰因素多,因此残留物不容易被分离和纯化。传统的样品前处理技术如索氏提取、液 - 液分配和柱层析等,操作烦琐复杂、耗时长、选择性差,提取与净化效率低,常出现误差,而且传统方法往往需要使用大量有毒溶剂,无法满足食品中农药残留分析安全、快速、准确的发展要求。国际上针对传统前处理技术的不足,发展了一些新技术,笔者就近年来在食品农药残留分析的样品前处理技术领域中得到迅速发展和广泛应用的固相萃取法( SPE) 、QuEChERS 法、凝胶渗透色谱法( GPC) 等技术进行了概述。

2. 2. 1 提取方法
2. 2. 1. 1 提取溶剂的选择 
提取溶剂的选择直接影响提取效果,其原理是相似相溶,因此溶剂的选择与农药的极性和提取方法等因素有关。首先要考虑提取溶剂的极性与农药极性的相似性,有机氯农药极性较小,应选择极性相对较弱的溶剂,如正己烷等; 有机磷农药及氨基甲酸酯类农药极性相对较强,一般采用二氯甲烷、丙酮、乙腈等提取。提取溶剂既可使用单一溶剂,也可以使用混合溶剂; 其次,农药残留量测定属于痕量分析,对提取溶剂的纯度要求甚高,应尽量选用优级试剂; 另外提取溶剂的沸点也应选择合适的范围,以避免过多的挥发或引起不稳[19] 。定农药的分解 

2. 2. 1. 2  提取方法 

应根据待测农药的性质、待测样品的种类和实验室条件选择适宜的提取方法。常见的方法有浸渍漂洗法、匀浆捣碎法、索氏提取法、振荡法、超声波提取法、微波辅助提取法、消化法等 。其中浸渍漂洗法、匀浆捣碎法为传统的提取方法,所需的提取溶剂较多,耗时久,提取效率也较差,现在较少使用; 索氏提取法是经典的提取法,主要是利用溶剂回流和虹吸原理,用脂溶性溶剂将脂肪和脂溶性物质提取出来,常用作脂肪含量较高的

( ) [21],样品 如母乳、奶粉等 中弱极性化合物的提取

但提取时间过长,干扰物质较多,现在的应用也不多。目前常用的方法主要有: a) 振荡法: 通过振动减小提取溶剂与样品之间传质界面的厚度,从而达到提高提取效率与速度的目的。这种方法的优点是溶剂利用率高、提取效率高。b) 超声波提取法: 通过一定品质的超声波使被束缚在生物细胞中的残留农药解离出来,数分钟甚至数十秒即可完成提取,大大提高了提取的速度和效率。此法是目前广泛使用的一种快速、高效的农药残留物提取法。c) 微波辅助提取法: 利用微波能强化溶剂提取效率,使得残留农药从样品基体中分离出来。此法快速且节省溶剂,适用于易挥发农药的提取,可同时进行多个样品[22]的操作 。

2. 2. 2 净化方法

2. 2. 2. 1 固相萃取法

固相萃取法是利用固态吸附剂吸附液态样品中的目标化合物,使其与样品中的基体和干扰化合物分离,之后再用洗脱液洗脱,或加热解离吸附,从而分离和富集目标化合物。固相萃取适合分离保留性质差别较大的化合物。与传统的液 - 液萃取法相比,固相萃取操作简单、回收率和分离效率高。但是固相萃取柱是一次性耗材,成本较高,不适用于大批量的样品前处理。固相萃取吸附剂种类较多,包括硅胶键合 C18 、氨基和石墨碳及[23]离子交换树脂及复合柱等 。根据需要可单柱使用也可多柱串联使用,还可以与其他净化技术联用,最大程度的去除基质干扰。目前,日本规定的农产[24]品中 262 种农药多残留检测方法的一齐检测法 、加拿大水果和蔬菜中 285 种农药多残留的测定方法以及美国加州食品农业部[California Department of Food and Agriculture ( CDFA) ]开发成功的用于 200多种农药残留的快速测定的快速扫描方法[Multi-residue screen method( MRSM) ]中都采用了固相萃取法对样品进行净化。我国 2006 年发布的国家标准 GB /T 19649 - 2006“粮谷中 475 种农药及相关化[25],学品残留量的测定” GB /T 19648 - 2006“水果和蔬菜中 500 种农药及相关化学品残留的测定 气26]相色谱 - 质谱法” 及 2008 年发布的国家标准GB /T 23202 - 2008“食用菌中 440 种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱 - 串联质谱法”GB /T 5009. 218 - 2008“水果和蔬菜中多种农药残[28]留量的测定” 均采用了固相萃取净化法。另有文献报道采用 Sep - PakVac 固相萃取柱净化方法测定[29],了生姜中 215 种农药残留 说明目前固相萃取方法作为基本的净化方法在国内已被广泛采纳和应用。

2. 2. 2. 2 QuEChERS 法

2003 年,美国农业部的Anastassiades 和 Lehotay 等在乙腈提取和分散固相萃取的基础上提出了一种新的样品前处理技术,由于该方法与传统样品前处理相比具有快速( quick) 、简单 ( easy) 、便宜 ( cheap) 、有效 ( effective) 、可靠 ( rugged) 和安全( safe) 的优点,因而被称为 QuECh-[30]ERS 方法 。该法通过与气相色谱 - 质谱法 ( GC - MS) 或液相色谱 - 质谱法( LC - MS) 联用,建立了蔬菜、水果中非常重要的一种农药多残留前处理方法。其原理与高效液相色谱和固相萃取相似,都是利用吸附剂与基质中的杂质相互作用,吸附杂质从而达到除杂净化的目的。2005 年,Lehotay 等基于 QuEchERS - 色质联用技术建立了一种最多能同时检测 229 种不同极性农药的方法,其平均回收率在70%  ~ 120% ,其 中 有 206  种 农 药 回 收 率在90% ~ 110% ,RSD 均小于 10% ,那些极易降解的农药如磺草灵、达草特、百菌清等的检测结果也较[31] [32] 改进了 QuEChERS 方法,并采好 。Nguyen 等用气相色谱 - 质谱 - 选择离子监测模式( GC - MS- SIM) 对卷心菜和萝卜等蔬菜中 109 种多农药残留进行检测,得到了满意的结果。目前 QuEchERS方法有 AOAC 标准方法 ( AOAC Official Method 2007. 01 Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and Partitioning with Magnesium Sulfate) 和欧洲标准化委员会的标准方法( Standard EN 15662Method) 2 [33] ,在实际工作中,实验人员还可版本以根据基质和提取物质的不同性质对方法进行优化。2007 年,中国农业大学也以该方法为前处理技术开发了用于水果蔬菜中农药残留检测的农业部标准 NY /T1380 - 2007“蔬菜、水果中 51 种农药多残[34] 。Carneiro RP留的测定  气相色谱 - 质谱法”[35] 以 QuEChERS 方法为前处理方法,以超高效液相色谱 - 串联质谱( UHPLC - MS /MS) 为分析检测方法测定了香蕉中 128 种农药多残留,该方法检测限为 5. 00 μg·kg - 1 ,定量限为 10. 00 μg·kg - 1 ,除甲胺磷外,回收率均在 70% ~ 120% 内。

2. 2. 2. 3 凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱法采用不同孔径的多孔凝胶装柱,一般采用 Bio - Beads S[36]- X3 作为填料 。根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离,大分子干扰物质如油脂、色素、聚合物等先被淋洗出来,由于农药相对分子质量较小,而后被洗脱出来。这种按分子大小的分离方式决定了凝胶渗透色谱法在理论上不存在死吸附,能反复使用。在农药多残留测定中,美国 FDA 官方方法( 食品中 360 种农药多残留检测方法) 、德国官方方法 DFG - S19 ( 食品中 229 种农药多残留的检测方法) 中均有采用凝胶渗透色谱法为净化方法。

[37] 利用凝胶渗透色谱净化方法结在我国,庞国芳等合气相色谱 - 质谱法、液相色谱 - 串联质谱法测定[38]家禽中 839 种化学污染物。姚翠翠等 建立了凝胶渗透色谱 - 气相色谱串联质谱法同时测定动物脂肪中 164 种农药的多残留分析方法,方法检出限 ( S /N≥3) 为 0. 1 ~ 360. 0 μg·kg - 1 ,其中 10. 0 μg· kg - 1 以下的有 121 种,占研究农药总数的 73. 8% 。

用猪、鸡、牛、羊 4 种不同的脂肪在低、中、高 3 个添加水平评价了 164 种农药的方法效率,其中有 150种的回收率在 70% ~ 120% 之间,相对标准偏差 ( RSD) 在 20% 以内。
2. 2. 2. 4 其他方法 包括固相微萃取( SPME) 、分子印迹合成受体( MISR) 、加速溶剂提取( ASE) 、在[39]线高效液相萃取、自动液 - 液分配等 。食品农药残留检测不仅需要高灵敏度的精密检测技术,还需要快速高效的样品前处理技术。不同的样品前处理技术有着不同的优缺点,在实际工作中,应根据待测样品性质、数量以及检测结果的要求,选用合适的样品前处理方法。

2.3  检测方法

自20 世纪 70 年代以来,配备了电子捕获检测器( ECD) 、氮磷检测器 ( NPD) 及火焰光度检测器 ( FPD) 的气相色谱法一直占据农药残留测定的主导地位。液相色谱法之所以应用较少主要是因为传统的紫外检测器、二极管阵列检测器和荧光检测器的灵敏度和选择性均不如气相色谱好。然而,在过去的几十年中,随着具备 ESI 源和 APCI 源的质谱的发展,这种局面发生了巨大改变。以质谱作为气相色谱或液相色谱的检测器,大大提高了检测的灵敏度,[40]逐渐成为农药残留量测定的主要方法 。笔者就常用的农药残留检测方法总结如下。

2. 3. 1 气相色谱法

多达 70% 的农药残留量检测都可以使用气相色谱法来进行。气相色谱具有操作简便、分析速度快、分离效能高、灵敏度高、应用范围广及可以同时分离分析多种组分等优点,广泛的用于相对分子质量较小、易气化的农药残留分析。美国加州食品农业部规定的农药多残留快速扫描方法,即 CDFA -MRSM 方法,适用于新鲜蔬菜、水果( 高水分、低脂肪类) 样品中未知四大类( 有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯) 200 多种农药残留的快速测定,该方法采用配置有专属性较强的 ECD、FPD 检测器的气相色谱法检测有机氯、有机磷、拟除虫菊酯三类气化后又不发生分解的农药残留。

2.3. 2 液相色谱法
液相色谱法是农药残留检测中不可缺少的重要方法,具有分离速度快、检测效率高、重复性好的特点,主要分离检测极性强、相对分子质量大的离子型农药,尤其对不易气化或受热易分解的农药更能显示其突出优点。上文提到的 CDFA - MRSM 方法即采用配置荧光检测器和柱后衍生系统的液相色谱法测定氨基甲酸酯类农药残留。但液相色谱法在分析组分比较复杂的样品时,选择性和灵敏度不如气相色谱法好。

2. 3. 3 气相色谱 - 质谱法

该方法包括气相色谱 - 质谱( gas chromatogra-phy - mass spectrometry,GC - MS) 、气相色谱 - 串联质谱 ( gas chromatography - tandem mass spectrome-try,GC - MS /MS) ,既具有气相色谱高分离效能,又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到同时[21] 。对农药残留量检测工作,定性定量的检测目的特别是检测农药代谢物、降解物和多残留等具有突出的优点,适用于挥发和半挥发性有机杀虫剂、除草剂等农药的残留分析,主要包括有机氯类、有机磷类、有机氮类、氨基甲酸酯类等化合物。我国 2006年颁布的国标 GB /T19648 - 2006“水果和蔬菜中500 种农药及相关化学品残留量的测定”中规定了苹果、柑橘、葡萄、甘蓝、芹菜、西红柿中 500 种农药及相关化学品残留量的气相色谱 - 质谱测定方法,方法检出限为 0. 0063 ~ 0. 8000 mg·kg - 1 。苏建林[41]
等 建立了固相萃取 - 气相色谱 - 质谱联用快速检测山药中 146 种农药多残留的分析方法,该方法定量下限为 0. 01 ~ 0. 048 mg·kg - 1 ,方法回收率范[42] 建立了气相色谱 -围为 68% ~ 122% 。马智玲等三重四极杆串联质谱法快速测定蔬菜水果中 129 种农药残留量的方法,该方法定量下限为 0. 03 ~ 16. 7μg·kg - 1 ,方法回收率范围为 66. 2% ~ 124. 7% 。机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯及唑类等191 种农药残留,方法的检出限为 0. 002 ~ 0. 3 mg· kg - 1 ,定量限为 0. 007 ~ 1. 2 mg·kg - 1 ,方法的回收率范围为 50. 2% ~ 120% ,其中 89. 5% 的农药的回收率为 70% ~ 120% ,相对标准偏差范围为 0. 6% ~[44]21. 6% 。Cajka 等 采用气相色谱 - 串联质谱技术检测了茶叶中的 135 种农药残留,方法的检测限为0. 001 ~ 0. 05 mg·kg - 1 ,回收率均在 70% ~ 120% 范围内。

2. 3. 4 液相色谱 / 超高效液相色谱 - 质谱法

液相色谱 / 超高效液相色谱 - 质谱法包括单极质谱检测技术、串联质谱检测技术及飞行时间质谱检测技术等。其综合了液相色谱的分离能力以及质谱可以得到选择离子的碎片离子的能力而形成的检测技术。液相色谱 / 超高效液相色谱作为质谱的进样器,利用其分离功能将混合物分离后按时间顺序依次进入质谱离子源。在质谱离子源中离子化后形成的离子由于质荷比不同,经质量分析器分离后到达质谱检测器,信号被检测放大,最终用于准确的定性定量检测。液相色谱 / 超高效液相色谱适于非挥发性、热不稳定性物质的分离,因而在农药多残留检[45] 建立测中具有不可替代的作用。Kovalczuk T 等了以 QuEChERS 法为前处理方法,以超高效液相色谱 - 串联质谱法为分析手段测定水果中 64 种农药残留及其毒性代谢产物的方法。Wang J 和 Leung46] ,D 同样以 QuEChERS 法提取净化 建立了超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间串联质谱测定以水果蔬菜为基质的婴儿食品中的 138 种农药多残留的方[47]法。吴斌等 利用高效液相色谱 - 四极杆 / 静电场轨道阱高分辨质谱快速筛选辣椒、青花菜、脱水土豆、大豆、绿茶和大蒜中 96 种农药残留。该方法在1 ~ 200 μg·L - 1 范围内线性关系良好。通过实际样品的加样回收试验,回收率范围为 58% ~ 105% ,检测限可以达到 5 μg·kg - 1 [48] 采用高效  。Pizzutti 等液相色谱 - 串联质谱法建立了大豆中 169 种农药残留量的分析方法,包括唑类、有机磷类、有机氮类、三嗪类等,方法的定量限为 10 ~ 50 μg ·kg - 1 ,其中70% 的农药的回收率范围为 70% ~ 120% 。国标GB /T20769 - 2008“水果和蔬菜中 450 种农药及相[49]

关化学品残留量的测定” 中也采用了液相色谱 -串联质谱法,方法检出限为 0. 01 μg·kg - 1 ~ 0. 606 mg·kg - 1 。

2.3. 5 快速检测技术常见的快速检测技术有免疫分析法、酶抑制法、化学速测法、活体检测法和生物传感器法等。
( 1) 免疫分析法: 主要分为酶联免疫分析和放射免疫分析,最常用的是酶联免疫分析( EusA) : 这种方法是基于抗体和抗原的特异性识别和结合反应,对于小分子量的农药需要制备人工抗原才能进行免疫分[50]

析 。该方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、安全可靠等优点,可广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。但是抗体制备难度较大,由于抗体有特异性,只适用于单一农药残留量的检测分析,不适合应用于多残留分析; ( 2 ) 酶抑制[51]:

法 这种方法是研究最成熟、应用最广泛的快速农药残留检测方法,主要是根据氨基甲酸酯类和有机磷类的农药对乙酰胆碱酶的特异性抑制反应; ( 3) 化学速测法: 主要是根据氧化还原反应,水解的产物与检测液相互作用导致变色,主要用于有机磷类的农药快速检测,但灵敏度较低,使用有局限性,而且容易受到还原性物质的干扰; ( 4) 活体检测法:主要是利用活体生物对于农药残留的敏感反应,如给家蝇喂食样品,观察死亡率来判定农药残留量等,该方法操作简单,但定性较粗糙、准确度较低,对农药的适用范围较窄。( 5) 生物传感器技术: 在农药残留检测领域中,主要利用农药对靶标酶( 如乙酰胆碱酯酶) 活性的抑制作用研究酶传感器,利用农药与特异性抗体相结合的反应特性研制免疫传感器,用于对相应农药残留物进行快速定性定量检[52] ,

测 。该方法具有分析样品的用量少 响应速度快的优点,甚至可以实现在线快速跟踪分析,但目前存在的主要问题是分析结果的稳定性差、重现性差、使用寿命短且使用成本高。

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